Главная >> Виноградарство >> Инфо >> ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ, флуоресцентная микроскопия, один из методов люминесцентного анализа. Осуществляется при помощи светооптического микроскопа и характеризуется высокой чувствительностью.

Впервые феномен люминесценции для микроскопич. исследований использовал австр. ученый А. Кёлер (1904). Им же совмество с австр. ученым Зидентопфом в 1908 сконструирован 1-й люминесцентный микроскоп. В 1911 рус. ботаник М.С. Цвет применил Л. м. для исследования собственной люминесценции хлорофилла в листьях растений. Л.м. используют при изучении эмбриологии и анатомии виноградного растения, а также микроорганизмов винограда, сусла и вина. ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ основана на применении в качестве источника энергии сине-фиолетовых или ультрафиолетовых лучей, получаемых от спец. источников света (ртутные газоразрядные лампы сверхвысокого давления, лампы с йодным циклом). При возбуждении молекул веществ, входящих в состав микроскопируемого объекта, коротковолновой частью видимого спектра ( Х= 400—450 нм) или ближним ультрафиолетом происходит эффект фотолюминесценции — облучение и излучение в виде световой энергии. Разновидностью фотолюминесценции является флуоресценция, проявляющаяся, когда излучение (свечение) происходит только во время облучения. Длина световой волны флуоресценции больше длины волны возбуждающего света (правило Стокса), в соответствии с чем цвет свечения меняется в сторону длинноволновой части спектра. Если, например, испытуемое вещество способно поглощать фиолетовый свет, оно может флуоресцировать любым светом видимого спектра (рис. П. Способность того или иного вещества поглощать свет определенной длины волны обусловливает характер флуоресценции, по которому судят о природе исследуемого объекта. Если объект включает в себя вещества разной природы, в поле зрения люминесцентного микроскопа (рис. 2) возникает многоцветная картина, являющаяся источником большого объема информации. Таким образом, благодаря Л.м. можно судить о некоторых физико-химических свойствах изучаемых клеток и тканей, определить форму, локализацию, пределы распространения и динамику изменения многих структур и веществ органических и минеральной природы.

Рис. 3. Люминесцентный микроскоп МЛ-4 (1) с фотометрической насадкой ФЭМЛ-1А (2), стабилизатором (3) и гальванометром (4)

Качественное свечение препарата зависит от правильности подбора светофильтров — оптических устройств, обеспечивающих явление люминесценции, т.е. свечения (излучения) веществ (тел). Светофильтры изготовляются из спец. стекол и заключены в стандартные оправы, на которых указана марка стекла. Светофильтры из фиолетового и синего стекла частично пропускают красные и инфракрасные лучи, в связи с чем их используют в сочетании с теплозащитными светофильтрами из стекол марки СЗС. Благодаря "запирающему" светофильтру (ЖС 3, ЖС 18, ЖС 18 в сочетании с ЖС 19 и др.) исследователь наблюдает только свет люминесценции и огражден от возбуждающего света. В Л. м. пригодны к использованию ахроматические объективы обычных микроскопов. Они позволяют исследовать объекты в различных длинах световых волн без перефокусировки и лишены собственного свечения под действием ультрафиолета. Флуоресценцию можно наблюдать при разных увеличениях, с высокоапертурными объективами (применяя нефлуоресцирующие иммерсионные жидкости), в проходящем свете, освещая препарат снизу, в отраженном свете, освещая сверху через объектив (падающий свет) с применением, при желании, смешанного освещения (сверху и снизу) и приспособления для фазового контраста. Своеобразно осуществляется освещение объекта возбуждающим светом сверху через объектив. При этом свет возникшей флуоресценции проходит через тот же объектив в обратном направлении. Технически это стало возможным благодаря спец. светоделительной пластинке, действующей как прозрачное зеркало. Она почти полностью отражает коротковолновую (возбуждающую) часть спектра, свободно пропуская свет флуоресценции. Описанный эффект происходит за счет интерференции света, отраженного от многослойного покрытия пластинки. СветодеЛительная интерференционная пластинка вмонтирована почти во все люминесцентные осветители и люминесцентные микроскопы. Действуя как конденсор, она усиливает яркость возбуждающего света, в связи с чем важно учесть, что с увеличением апертуры яркость значительно возрастает, обеспечивая больший выход люминесценции. Более яркую картину флуоресценции при падающем свете дают сильные, высокоапертурные объективы.

В зависимости от условий и целей исследования можно использовать микроскопы серии Люмам (Р-1, Р-2, Р-3, И-3), дорожный МЛД, осветители ОИ-28, ОИ-18 и ОИ-30 с т.н. контактными объективами, наборы контактных объективов (ОЛК-1, ОЛК-2), стереоскопический агрегатный микроскоп Люсам-1, состоящий из стереоскопического микроскопа и осветителя ОИ-18, и др. Наиболее совершенный — люминесцентный микроскоп МЛ-4 (рис. 3). Для регистрации интенсивности и спектра флуоресценции микроскопы снабжаются фото-метрич. насадкой, приспособлением для фотографирования и др. Выраженной собственной люминесценцией обладают хлорофилл, ткани побега, корней и листьев виноградного растения, культуры многих микроорганизмов, некоторые плесневые грибы. Объекты (например, ткани частей цветка винограда, пыльца, живые клетки винных дрожжей, некоторые бактериальные клетки), лишенные собственной (первичной) флуоресценции, предварительно обрабатывают флуорохромами, т.е. флуоресцирующими веществами природного и синтетической происхождения. В качестве флуорохромов применяют акридиновый оранжевый, берберин сульфат, корифосфин, анилиновый синий, титановый желтый, при-мулин и др. Для определения процента живых бактериальных и дрожжевых клеток чаще всего применяют слабый (0,01—0,00001%-ный) раствор примулина. Флуорохром проникает в мертвые структуры и связывается с их денатурированными белками.

На Л. м. основаны многие экспресс-методы исследования: определение количества хлорофилла, строения побега и степени его вызревания, структуры мякоти ягоды, оплодотворяющей способности пыльцы, скорости прорастания пыльцы на рыльцах и роста пыльцевых трубок в пестике, выяснение степени совместимости при опылении и др. (рис. 4—8), а также быстрый метод определения живых и мертвых клеток дрожжей в вине.

Литература: Мейсель М. Н. Некоторые итоги и перспективы применения люминесцентной микроскопии в биологии. — Изв. АН СССР. Сер. физ., 1949, т. 13, №2; Люминесцентный анализ / Под ред. М.А. Константиновой-Шлезингер. — Москва, 2001; Бурьян Н. И. и др. Дифференциация живых и мертвых микроорганизмов вина при помощи люминесцентной микроскопии. — Тр. / ВНИИВиВ "Магарач", 1970, т. 17; Букатарь П. И., Литвак А. И. Маленький вопрос из большой науки о винограде. — Садоводство, 1975, №7; Атлас по эмбриологии винограда. — К., 1997; Литвак А. И. Люминесцентная макро- и микроскопия в исследованиях плодовых культур и винограда. — К., 1978; Staut G. Pollenkeimung und Pollenschlauchwachstum in vivo bei Vitis und die Abhangigkeit von der Temperatur. — Vitis, 1982, Bd. 21, H. 3.

 
< ЛЮКСМЕТР   МАКРОСПОРА >